Superar los desafíos para sintetizar iro

Los científicos desarrollan un protocolo eficiente en un solo recipiente para la síntesis sin células de proteínas complejas de hierro y azufre

Instituto de Tecnología de Tokio

Imagen: Este diagrama muestra los dos pasos principales involucrados en el protocolo de síntesis propuesto. El paso 1 muestra la cascada química utilizada para crear un entorno libre de oxígeno, junto con el sistema PURE utilizado para sintetizar las proteínas "inmaduras" (apo). El paso 2 muestra la implementación de la maquinaria SUF, que agrega el grupo [4Fe-4S] a las proteínas apo, produciendo proteínas [4Fe-4S] funcionales y maduras.ver más

Crédito: Reproducido de Wang y Nishikawa et al. 2023 ACS Biología Sintética

Los grupos de Fe-S, que forman parte de las proteínas Fe-S, se encuentran en todas las formas de vida. Desempeñan un papel importante como cofactores biológicos (moléculas auxiliares que ayudan a estas proteínas en diferentes transformaciones bioquímicas) que participan en la respiración y el metabolismo. Estos grupos son de gran interés para la investigación, ya que se consideran una parte crítica de la evolución. Sirven como vínculo entre la química prebiótica (procesos químicos que existieron antes del surgimiento de las formas de vida) y los complejos sistemas moleculares y biológicos que conocemos hoy. En pocas palabras, podrían ser uno de los catalizadores primitivos que llevaron al surgimiento de la vida en la Tierra. Por lo tanto, es de esperar que contar con métodos convenientes para sintetizar proteínas Fe-S mejore nuestra comprensión de la biología de la Tierra joven y nos ayude a responder la pregunta fundamental sobre el origen de la vida.

Sin embargo, a pesar de su prevalencia, la síntesis de proteínas Fe-S maduras fuera de la célula ha demostrado ser un desafío. No sólo requieren una intrincada maquinaria celular para su síntesis, sino que también se degradan fácilmente al entrar en contacto con el oxígeno debido a su reacción con sus grupos Fe-S. Por lo tanto, los científicos se vieron obligados a seguir la complicada ruta de producir y extraer primero una proteína incompleta (o "apo"), seguida de su maduración (adición del cofactor Fe-S) en condiciones estrictamente privadas de oxígeno. Pero lo que hace que este proceso sea aún más difícil es la presencia de proteínas contaminantes que contienen hierro en el extracto final.

En un estudio reciente, un equipo de investigadores, incluidos los profesores asociados Kosuke Fujishima y Shawn McGlynn del Earth-Life Science Institute (ELSI), el Instituto de Tecnología de Tokio y el profesor asistente Po-Hsiang Wang de la Universidad Nacional Central desarrollaron un protocolo novedoso para produciendo proteínas maduras [4Fe-4S] en las que el grupo Fe-S se coloca dentro de una estructura similar a un cubo. El equipo ideó una vía especializada del sistema de proteínas de ensamblaje de Fe-S que funcionaría en un ambiente libre de oxígeno debido a la presencia de un sistema de eliminación de oxígeno para administrar proteínas Fe-S maduras.

Los investigadores primero intentaron ensamblar lo que se conoce como el sistema de formación de azufre (SUF). En las bacterias, este sistema multiproteico contiene toda la maquinaria necesaria para producir grupos [4Fe-4S]. Tiene una mayor tolerancia al oxígeno en comparación con otras vías con funciones similares (como la fijación de nitrógeno y su sistema de agrupación on-azufre). El equipo de investigación creó una vía SUF recombinante que consta de seis subunidades de proteínas con la capacidad de funcionar en un entorno libre de células.

Para mantener un ambiente libre de oxígeno dentro del tubo de ensayo, los investigadores introdujeron una cascada de tres enzimas (un conjunto de tres reacciones enzimáticas que ocurren en una secuencia) que sirve como un sistema de eliminación de oxígeno. Si bien este sistema de eliminación elimina oxígeno del medio ambiente, también mejora la eficiencia del sistema. Lo logra produciendo dinucleótido de flavina adenina reducido (FADH2), un portador de electrones necesario para la síntesis del grupo Fe-S mediante el sistema SUF.

Finalmente, para la síntesis de la proteína apo, el equipo adoptó un método libre de células especializado que permite la producción in vitro de proteínas mediante el uso de la síntesis de proteínas libres de células reconstituidas conocida como sistema PURE. Con la adición de material genético (ADN o ARNm) y las fuentes de energía necesarias, el sistema PURE actúa esencialmente como una fábrica de proteínas artificiales.

Por lo tanto, los investigadores combinaron el sistema PURE, la cascada de enzimas eliminadoras de O2 y los componentes de la vía SUF en un solo tubo para realizar la síntesis sin células en un solo recipiente de dos proteínas representativas [4Fe-4S]: aconitasa y termófila. ferredoxina. Al explicar los procesos iterativos experimentados para lograr que las piezas del rompecabezas encajen, el coautor primer estudiante de doctorado Shota Nishikawa comenta: "fue un desafío dar con la estequiometría y la concentración de sustrato/cofactor apropiadas. Sin embargo, realizamos un análisis exhaustivo estudios para caracterizar la proporción adecuada de enzimas necesarias en el sistema PURE".

El protocolo desarrollado en este estudio tiene implicaciones importantes para la comunidad científica. "Hemos creado un método novedoso y práctico para la síntesis de proteínas Fe-S maduras que ya no requiere una caja de guantes voluminosa", destaca Fujishima. Afirma que su protocolo supera los desafíos tradicionales del ensamblaje del grupo [4Fe-4S] y la sensibilidad al O2, que han sido obstáculos importantes en los campos de la biología sintética y la enzimología anaeróbica. Al ampliar enormemente las capacidades del sistema PURE, la estrategia propuesta por los investigadores podría conducir al desarrollo de nuevas biotecnologías y a una mejor comprensión de los fundamentos de la síntesis y el ensamblaje de proteínas.

Con la vista puesta en el futuro, los investigadores señalan que este trabajo abre varias puertas para próximos estudios. Ser capaz de implementar entornos libres de oxígeno in vitro podría ayudar a los científicos a replicar otros tipos de vías multiproteicas, como las vías de fijación de nitrógeno (NIF), andirón-azufre (ISC), para sintetizar otras enzimas portadoras de cofactores metálicos. Esto, a su vez, puede conducir al desarrollo de nuevos biocatalizadores y células sintéticas, con posibles aplicaciones en la remediación ambiental, la producción de energía, la medicina y la astrobiología.

Referencia

Po-Hsiang Wang1,2*, Shota Nishikawa3,4, Shawn Erin McGlynn3,5 y Kosuke Fujishima3,6*, Síntesis One-Pot De Novo de proteínas [4Fe-4S] utilizando un sistema SUF recombinante en condiciones aeróbicas, ACS Synthetic Biología, DOI: 10.1021/acssynbio.3c00155

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Biología sintética ACS

10.1021/acssynbio.3c00155

Estudio experimental

No aplica

Síntesis de novo en un recipiente de proteínas [4Fe-4S] utilizando un sistema SUF recombinante en condiciones aeróbicas

19-jul-2023

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